Técnicas de punción y biopsia de médula ósea en primates no humanos: enfoque en la aplicación de agujas de biopsia

Los primates no-humanos (NHP) son animales de experimentación fundamentales para la investigación hematológica preclínica, el desarrollo de fármacos con células madre, la exploración del mecanismo inmunológico y los estudios de medicina traslacional. Las muestras de médula ósea completas y de alta-calidad, baja-contaminación son la premisa y la base de datos experimentales confiables. La punción de médula ósea y la biopsia central son las técnicas de muestreo de médula ósea in vivo más utilizadas en primates no-humanos. A diferencia de la extracción de sangre venosa ordinaria, esta tecnología se basa en agujas de biopsia huecas, duras y profesionales para penetrar el hueso cortical de los huesos largos y planos, y obtener líquido calificado de la médula ósea y tejidos centrales intactos de la médula ósea de la cavidad medular. Toda la operación depende en gran medida de las especificaciones de rendimiento, la coincidencia de modelos y la aplicación estandarizada de las agujas de biopsia de médula ósea. En combinación con protocolos maduros de experimentos con animales y experiencia en la literatura, este artículo elabora sistemáticamente las-especificaciones de operación del proceso completo de punción y biopsia de médula ósea de NHP, centrándose en las características de selección, las ventajas de aplicación y los elementos esenciales de operación estandarizada de las agujas de biopsia dedicadas, para proporcionar una guía técnica estandarizada para los investigadores experimentales.

El principio técnico básico de la punción y biopsia de médula ósea en primates no{0}}humanos es coherente con el sistema clásico de muestreo de médula ósea canina (Crow et al., 2009). La lógica central es utilizar agujas de biopsia huecas y rígidas para atravesar la barrera dura del hueso cortical, localizar con precisión la cavidad medular y obtener muestras de líquido de médula ósea y muestras de núcleos sólidos mediante aspiración con presión negativa e incrustación de corte giratorio. Según las características anatómicas de los NHP, los sitios de muestreo comunes se dividen en áreas de extremidades anteriores y posteriores. Los sitios de muestreo prioritarios de las extremidades posteriores incluyen la cresta ilíaca y la fosa trocantérica femoral (Wolf & White, 2012), que son adecuados para la mayoría de los modelos de primates de tamaño mediano y grande-; el sitio alternativo de la extremidad anterior es el tubérculo mayor humeral, con una posición anatómica poco profunda y una operación conveniente, adecuada para muestreo complementario y experimentos de muestreo repetidos. Los diferentes sitios de muestreo tienen diferencias en el grosor del hueso, el diámetro de la cavidad medular y la cobertura de tejido blando, que deben coincidir con las especificaciones correspondientes de las agujas de biopsia de médula ósea para garantizar la eficiencia del muestreo y la calidad de la muestra.

Como operación ósea invasiva, la punción y biopsia de médula ósea del NHP provocarán una estimulación definitiva del tejido y una respuesta al dolor. Para garantizar el bienestar animal y un funcionamiento experimental estable, todas las operaciones de muestreo deben realizarse bajo anestesia estandarizada. Los investigadores pueden seleccionar anestesia general o anestesia local dirigida según el ciclo experimental, la frecuencia de muestreo y el estado individual del animal, para lograr suficiente analgesia intraoperatoria y posoperatoria. Además, todo el proceso debe cumplir estrictamente con las especificaciones experimentales estériles, incluido el afeitado preoperatorio y la preparación de la piel del área de muestreo, la desinfección multi-estándar con povidona yodada-y alcohol, la colocación de toallas esterilizadas y el uso de guantes e instrumentos quirúrgicos esterilizados, para evitar eficazmente infecciones locales, inflamación de heridas y otras complicaciones postoperatorias que afecten a los experimentos repetidos posteriores.

Clasificación, selección y ventajas de rendimiento de las agujas especiales para biopsia de médula ósea

La aguja de biopsia de médula ósea es el instrumento de precisión principal del muestreo de médula ósea del NHP, que determina la tasa de éxito de una punción única-, la integridad de la muestra y el grado de contaminación de la sangre periférica. En la actualidad, existen múltiples modelos comerciales maduros de agujas especiales para muestreo de médula ósea para animales de experimentación, incluidas las agujas esternal/ilíaca de Rosenthal, Klima, Illinois y la aguja Jamshidi. Cada modelo tiene un diseño diferenciado en longitud de la aguja, diámetro del calibre, estructura del núcleo interno y agarre manual, adaptándose a diferentes tipos de cuerpo de animales, características anatómicas óseas y propósitos de muestreo experimental.

Entre todos los tipos de agujas, laAguja de biopsia de médula ósea Jamshidi 14Ges el estándar de oro para la biopsia central de médula ósea NHP, que es la especificación más recomendada para operaciones experimentales. Este tipo de aguja de biopsia adopta una estructura hueca rígida optimizada, con un estilete central sólido a juego. El cuerpo de la aguja tiene una dureza y tenacidad moderadas, lo que puede penetrar eficazmente el hueso cortical de los primates sin doblarse ni deslizarse. El borde cortante en espiral en la punta de la aguja puede incrustar e interceptar de manera estable tejidos centrales completos de la médula ósea, evitando la fragmentación de la muestra y el daño por extrusión del tejido causado por tipos de agujas no profesionales. En comparación con las agujas de aspiración de calibre delgado-, la aguja de biopsia Jamshidi 14G tiene un diámetro de cavidad interna más grande, lo que puede obtener muestras centrales de volumen suficiente-y al mismo tiempo garantizar la seguridad, satisfaciendo las necesidades de detección morfológica, corte de tejido y análisis de índice experimental de la biopsia central. En comparación con las agujas gruesas de gran tamaño, puede reducir eficazmente el traumatismo óseo excesivo y el sangrado intraoperatorio, equilibrando la calidad de la muestra y la utilización repetible del animal.

Todas las agujas especiales para biopsia de médula ósea están diseñadas con un estilete central a juego, que es una característica estructural clave diferente de las agujas de inyección comunes. El estilete puede bloquear completamente la cavidad hueca del cuerpo de la aguja durante la punción, evitar que los tejidos blandos de la piel y los restos óseos entren en la cavidad de la aguja para bloquear la tubería y garantizar el progreso fluido de la posterior aspiración con presión negativa y el corte del tejido central. En experimentos de muestreo repetidos, los investigadores deben seleccionar las especificaciones de las agujas según el peso corporal del animal y el tamaño de los huesos: agujas de biopsia de calibre corto y fino-para primates pequeños (peso corporal inferior a 5 kg) y agujas Jamshidi convencionales de longitud media-de 14G para individuos medianos y grandes, logrando una combinación precisa de equipos y objetos experimentales.

Precauciones preoperatorias clave para la toma de muestras con aguja de biopsia

Para evitar la coagulación, hemólisis y contaminación de las muestras, y mejorar la tasa calificada de muestras experimentales, se deben implementar especificaciones estandarizadas de pretratamiento y operación para agujas de biopsia antes del muestreo. Primero,Pretratamiento con anticoagulación con heparina de agujas y jeringas.es obligatorio. Antes de usar, extraiga una pequeña cantidad de solución de heparina para lavar la pared interna de la aguja de biopsia y la jeringa correspondiente, y descargue completamente el líquido residual, formando una capa uniforme de anticoagulante de heparina en la pared interna de la cavidad de la aguja. Esta operación puede prevenir eficazmente la rápida coagulación del líquido de la médula ósea después del muestreo, evitar el fallo en la preparación del frotis y la detección de células causado por la coagulación de la muestra y es el paso previo clave al tratamiento para la adquisición de líquido de la médula ósea de alta-calidad.

En segundo lugar, en el caso de experimentos con animales de muestreo repetido-a largo plazo,selección rotacional de sitios de punciónSe debe adoptar para evitar punciones repetidas en un solo sitio, lo que puede provocar hiperplasia del hueso cortical, adhesión del tejido local y aumento de la resistencia a la punción, lo que resulta en fallas en el muestreo y un mayor traumatismo en los animales. En términos de esquema de analgesia, la inyección de analgésico local en la piel y el tejido blando profundo del sitio de punción es superior a la anestesia general simple, que puede aliviar eficazmente el dolor y la incomodidad de la herida posoperatoria, reducir la respuesta al estrés de los animales y facilitar la recuperación posoperatoria y los experimentos repetidos posteriores.

En términos de control del volumen de muestreo, limitado por la capacidad de la cavidad de la aguja de biopsia y el volumen de sangre fisiológico de los animales de experimentación, el volumen de muestreo de un solo sitio de punción no deberá exceder los 2 ml. Una extracción excesiva provocará una dilución grave de la sangre periférica, reducirá la proporción de células nucleadas y tejidos activos de la médula ósea en la muestra, interferirá con los resultados de la detección experimental y afectará la precisión del análisis del índice hematológico y la observación morfológica del tejido.

Procedimiento operativo estándar para la punción de la cresta ilíaca (operación con aguja para biopsia central)

La cresta ilíaca es el sitio de muestreo más convencional y preferido para la biopsia de médula ósea de primates no-humanos, con hueso cortical grueso, rico tejido hematopoyético de la cavidad medular y pocos órganos importantes adyacentes, lo que presenta una alta seguridad y una alta tasa de éxito de muestreo. Después de que el animal esté completamente anestesiado, colóquelo en posición boca abajo, doble ambas extremidades inferiores debajo del abdomen para levantar el hueso de la cadera y exponer completamente el área de muestreo de la cresta ilíaca. La mayoría de los primates no-humanos tienen pelo escaso en el área de la cresta ilíaca, que sólo necesita un simple afeitado y preparación de la piel. La piel se desinfecta alternativamente con povidona-yodada y alcohol, y se coloca una toalla esterilizada para aislar el área quirúrgica y garantizar un funcionamiento estéril.

Después de confirmar el límite de la cresta ilíaca mediante palpación, realice una pequeña incisión en la piel con un bisturí quirúrgico estéril en el lado anterior de la cresta ilíaca para reducir la resistencia a la fricción de la aguja de biopsia durante la penetración. Alinee la aguja de biopsia Jamshidi 14G con la incisión, avance lentamente hasta el borde dorsal anterior de la cresta ilíaca, mantenga el cuerpo de la aguja perpendicular al plano de la cresta ilíaca todo el tiempo y aplique una presión hacia abajo continua y estable mientras gira el cuerpo de la aguja en el sentido de las agujas del reloj. La postura vertical de inserción de la aguja es la clave para una biopsia exitosa, que puede garantizar que la punta de la aguja ingrese con precisión en la cavidad medular, evitar la penetración oblicua que provoque la división del hueso cortical y daño al tejido adyacente, y maximizar el rendimiento de corte y muestreo de la punta de la aguja de biopsia.

Cuando el cuerpo de la aguja penetra el hueso cortical, el operador obviamente sentirá la reducción repentina de la resistencia a la penetración y la aguja de biopsia se puede fijar de manera estable en el tejido óseo sin temblar, lo que indica que la punta de la aguja ha ingresado con éxito en la cavidad medular. En este momento, extraiga completamente el estilete central, conecte una jeringa estéril de 10 ml a la cola de la aguja de biopsia y aplique una presión negativa estable tirando del pistón. La médula ósea fresca de primate es de color rojo oscuro y espumosa, tiene mayor viscosidad que la sangre periférica y contiene un diminuto tejido óseo trabecular de color claro-, que es una muestra calificada de médula ósea.

Si no se extrae líquido de la médula ósea, no extraiga el cuerpo de la aguja a ciegas. Gire la aguja de biopsia entre 90 y 180 grados para ajustar el rango de corte y muestreo de la punta de la aguja; Si aún no es válido, vuelva a insertar el estilete, ajuste ligeramente la profundidad del cuerpo de la aguja hacia adelante o hacia atrás y aplique presión negativa nuevamente. Para muestras experimentales de diagnóstico, el volumen de muestreo de un solo sitio se controla dentro de 1 ml para garantizar la pureza de la muestra; Si se requiere un gran volumen de muestras de médula ósea para los experimentos, se seleccionarán múltiples sitios de punción para el muestreo en lugar de una extracción excesiva en un solo sitio. Después del muestreo, retire rápidamente la aguja de biopsia, aplique hemostasia de compresión directa en el sitio de punción durante un tiempo prolongado y suture la piel con una sutura de un solo hilo si se produce un sangrado persistente.

Operación de punción y biopsia de la fosa trocantérea femoral y el extremo proximal humeral

La fosa trocantérea femoral es un sitio de muestreo complementario ideal para pequeños primates no-humanos (peso corporal<5kg). The local bone structure is shallow, and the medullary cavity is concentrated, which is convenient for the positioning and penetration of fine-gauge biopsy needles. However, the proximal thigh muscle layer of large primates is thick, resulting in large puncture resistance and difficult operation. The core operation principle is consistent with iliac crest biopsy: place the animal in lateral position, hold the proximal thigh with the palm, locate the trochanteric fossa at the inner and distal side of the femoral greater trochanter by thumb palpation, insert the biopsy needle toward the femoral shaft to penetrate into the medullary cavity, and complete negative pressure aspiration and specimen collection according to the standard needle operation procedure.

El húmero proximal es otro sitio de muestreo alternativo eficiente. El diámetro del hueso largo del húmero es mayor y la cavidad medular es más ancha y menos profunda, lo que hace que el posicionamiento de la aguja de biopsia sea más preciso y la operación más sencilla. Coloque al animal en posición lateral, sostenga la extremidad anterior proximal, palpe el surco intertubercular entre los tubérculos mayor y menor del húmero, inserte la aguja de biopsia hacia la diáfisis humeral para ingresar a la cavidad medular. Este sitio tiene bajos requisitos de precisión del cuerpo de la aguja, baja tasa de fallas de punción y es adecuado para muestreos rápidos y experimentos con animales por lotes.

Método de perfusión de huesos largos y aplicación en profundidad de la aguja de biopsia central-

A diferencia de la punción convencional con una sola-aguja, el método de perfusión de huesos largos (Kushida et al., 2000) es una tecnología de muestreo de médula ósea de alta-pureza adecuada para experimentos de alta-precisión, que requiere el uso cooperativo de dos agujas de biopsia de médula ósea. La operación requiere insertar agujas de biopsia compatibles en la cavidad medular en ambos extremos del eje del hueso largo respectivamente, inyectar solución salina normal estéril lentamente a través de una aguja de biopsia y recolectar la médula ósea-que contiene el perfundido en un recipiente cerrado estéril a través del tubo de extensión conectado a la otra aguja. Este modo de muestreo cooperativo con doble-aguja evita eficazmente la contaminación de la sangre periférica en la punción convencional, y las muestras de médula ósea obtenidas tienen una mayor pureza, lo que es adecuado para la separación de células madre, cultivos in vitro y experimentos de detección ómica de alta-precisión.

Operación diferenciada de aspiración de médula ósea y biopsia central basada en agujas de biopsia

La aspiración de médula ósea y la biopsia central comparten el mismo sitio de muestreo y equipo de aguja de biopsia, pero la lógica de operación de la aguja posoperatoria es completamente diferente, lo que determina los dos tipos de muestras experimentales: líquido líquido de la médula ósea y tejido central sólido de la médula ósea. Enaspiración de médula ósea, después de fijar la aguja de biopsia en la cavidad medular, extraiga el estilete y conecte una jeringa para aplicar presión negativa para extraer líquido líquido de la médula ósea, que se utiliza para el recuento de células, la morfología del frotis y la detección de citometría de flujo.

Enbiopsia central de médula óseacentrándose en las muestras de tejido, después de retirar el estilete, la aguja de biopsia Jamshidi avanza 1 a 2 cm hacia la cavidad medular mediante una presión estable y una rotación lenta. El filo en espiral en la punta de la aguja puede envolver completamente el tejido central de la médula ósea. Luego, afloje el cuerpo de la aguja girándolo y balanceándolo, retraiga ligeramente y reinsértelo para separar la parte inferior del tejido central de la trabécula ósea. Después de confirmar que el tejido está completamente separado, extraiga la aguja de biopsia integralmente mediante tracción giratoria. Finalmente, empuje la muestra intacta del núcleo de médula ósea sólida fuera de la cavidad de la aguja con un empujador lineal y fíjela con formalina al 10% para la sección del tejido y el análisis patológico.

Conclusión

La aplicación estandarizada de agujas para biopsia de médula ósea es la clave fundamental para el éxito de los experimentos de punción y biopsia de médula ósea en primates no-humanos. La aguja de biopsia Jamshidi 14G, con su diseño estructural optimizado y rendimiento de muestreo estable, es el equipo preferido para la biopsia central de NHP. Los investigadores deben seleccionar las especificaciones de las agujas según el tipo de cuerpo del animal y los propósitos experimentales, implementar estrictamente el pretratamiento con heparina, la operación estéril y los protocolos de rotación del sitio, y dominar las técnicas de operación diferenciadas de aspiración y biopsia central. La selección y el funcionamiento estandarizados de las agujas pueden mejorar eficazmente la pureza y la integridad de las muestras, reducir los traumatismos en animales y los errores experimentales, y proporcionar un soporte técnico sólido para la investigación en hematología preclínica y medicina traslacional basada en modelos de primates no-humanos.